Autores e Biografia

Matias, Fernanda (Organizador)

Sumário

Parte I – Organizando o laboratório

Capítulo 1 – Boas práticas de laboratório
1.1 Princípios gerais
1.1.1 Noções básicas de organização do pessoal da unidade de operação
1.1.2 Local de trabalho, reagentes, material de uso comum e equipamentos
1.1.3 Manutenção das instalações
1.2 Cuidados específicos em um laboratório
1.2.1 Pipetadores e micropipetadores automáticos
1.2.2 Câmara de controle biológico (“fluxo laminar”)
1.2.3 Autoclaves
1.2.4 Centrífugas
1.2.5 Materiais combustíveis e inflamáveis
1.2.6 Cabine química (capela)
1.2.7 Material criogênico e traps de resfriamento
1.2.8 Aparelhos e equipamentos elétricos
1.3 Limpeza de bancadas
1.3.1 Diluições para soluções básicas de limpeza
1.4 Descarte de materiais
1.4.1 Procedimentos gerais de descarte
1.4.1.1 Resíduos químicos
1.4.1.2 Resíduos perfurocortantes
1.4.1.3 Material biológico
Referências


Capítulo 2 – Biossegurança
2.1 Riscos de acidentes
2.2 Riscos ergonômicos
2.3 Riscos físicos
2.4 Riscos químicos
2.5 Riscos biológicos
2.5.1 Níveis de contenção física para riscos biológicos
2.6 Montando o manual de biossegurança do laboratório
2.6.1 Noções básicas de segurança do pessoal da unidade de operação
2.6.2 Saúde e higiene
2.6.3 Cuidados gerais
2.6.4 Higienização das mãos
2.6.5 Equipamentos e procedimentos de emergência
2.6.6 Acidente com produtos químicos
2.6.7 Acidente com material biológico
2.6.8 Acidente com incêndio
2.7 Mapa de risco
2.8 Métodos de controle de agentes de riscos
Referências


Capítulo 3 – Procedimento Operacional Padrão (POP)
3.1 Como fazer um POP
3.2 Principais passos para se elaborar um POP
3.3 Exemplo de POP
3.3.1 Considerações gerais
3.3.1.1 Desinfecção
3.3.1.2 Esterilização
3.3.1.3 Limpeza
3.3.1.4 Saneante
3.3.2 Equipamentos e produtos
3.3.2.1 Equipamentos
3.3.2.2 Produtos
3.3.3 Procedimento
3.3.3.1 Como usar a autoclave vitale
3.3.3.2 Como usar a estufa de leo
Referências


Parte II – DNA

Capítulo 4 – Extração de DNA
4.1 Tampões e reagentes – DNA
4.1.1 Solução fenol-sevag
4.1.1.1 Atenção
4.1.2 Solução sevag
4.1.3 Tampão TE
4.2 Protocolos de extração de DNA genômico
4.2.1 Equipamentos necessários
4.2.2 Extração de DNA genômico de fungos
4.2.2.1 Reagentes
4.2.2.2 Procedimento
4.2.3 Extração de DNA genômico de bactérias gram-negativas
4.2.3.1 Reagentes
4.2.3.2 Procedimento
4.2.4 Extração de DNA genômico de bactérias gram-positivas
4.2.4.1 Reagentes
4.2.4.2 Procedimento
4.2.5 Protocolo rápido para extração de DNA genômico de bactérias gram-positivas ou gram-negativas
4.2.5.1 Reagentes
4.2.5.2 Procedimento
4.2.6 Protocolo para extração de DNA genômico de leveduras
4.2.6.1 Reagentes
4.2.6.2 Procedimento
4.2.7 Extração de DNA genômico foliar
4.2.7.1 Reagentes
4.2.7.2 Procedimento
4.2.8 Extração de DNA genômico de linhagens celulares humanas
4.2.8.1 Reagentes
4.2.8.2 Procedimento
4.2.9 Extração de DNA genômico de células animais
4.2.9.1 Reagentes
4.2.9.2 Procedimento
4.2.10 Extração pelo método de Salting Out – sangue
4.2.10.1 Reagentes
4.2.10.2 Procedimento
4.2.11 Extração de DNA animal pelo método orgânico em membrana concentradora
4.2.11.1 Reagentes
4.2.11.2 Procedimento
4.3 Extração de DNA para PCR
4.3.1 Fungos
4.3.1.1 Reagentes
4.3.1.2 Procedimento
4.3.2 Bactérias
4.3.2.1 Procedimento
Referências


Capítulo 5 – Limpeza, análise e manipulação de DNA
5.1 Limpeza de DNA ‒ Desproteinização
5.2 Precipitação de DNA
5.2.1 Precipitação com cloreto de sódio e etanol
5.2.1.1 Reagentes
5.2.1.2 Procedimento
5.2.2 Precipitação com acetato de amônia e isopropanol
5.2.2.1 Reagentes
5.2.2.2 Procedimento
5.2.3 Precipitação com acetato de sódio e etanol
5.2.3.1 Reagentes
5.2.3.2 Procedimento
5.3 Limpeza de DNA com RNase
5.3.1 Solução de RNase
5.3.2 Procedimento
5.4 Gel de agarose para análise de DNA
5.4.1 Corante de corrida de gel de agarose
5.4.2 Tampão TAE (50x) pH 8,0
5.4.3 Tampão TBE (10x)
5.4.4 Procedimento
Referências


Capítulo 6 – Restrição do DNA
6.1 Restrição simples
6.1.1 Protocolo padrão
6.1.2 Protocolo utilizado para restrição simples de produto de PCR
6.1.3 Protocolo utilizado para restrição simples de plasmídeo
6.2 Restrição dupla
6.2.1 Protocolo padrão
6.2.2 Protocolo utilizado para restrição dupla de produto de PCR
6.2.3 Protocolo utilizado para restrição dupla de plasmídeo
6.3 Procedimento
6.4 Ligação de DNA
6.4.1 Protocolo padrão
6.4.2 Protocolo alternativo
6.4.3 Procedimento
6.5 Restrição com enzima coesiva ou de pontas cegas
6.5.1 Limpeza
6.5.1.1 Procedimento
6.5.2 Embotamento com DNA Klenow
6.5.2.1 Procedimento
6.5.3 Embotamento com T4 DNA polimerase
6.5.3.1 Procedimento
6.5.4 Desfosforilação do plasmídeo
6.5.4.1 Procedimento
Referências


Parte II – RNA

Capítulo 7 – Manipulação do RNA
7.1 Manipulação geral
7.2 Plásticos descartáveis e não descartáveis
7.3 Vidraria
7.4 Soluções
7.4.1 Reagentes
7.4.2 Procedimento
7.5 Tratamento de soluções com DEPC
7.5.1 Procedimento
7.6 Eletroforese de RNA em gel de agarose
7.6.1 Cubas de eletroforese
7.6.2 Tampões
7.6.2.1 Tampão de aplicação formaldeído 10x
7.6.2.2 Tampão MOPS 10x (1 L)
7.6.2.3 Tampão de reação 1x (por amostra)
7.7 Aplicação de amostra
7.7.1 Reagentes
7.7.2 Procedimento
7.8 Extração de RNA
7.8.1 Extração de RNA utilizando o TRIZOL
7.8.1.1 Reagentes
7.8.1.2 Procedimento
7.9 Armazenamento do RNA
7.10 Quantificação do RNA
7.10.1 Lavagem das cubetas de quartzo
7.10.1.1 Reagentes
7.10.1.2 Procedimento
7.11 Pureza do RNA
7.12 Contaminação por DNA
7.13 Integridade do RNA
7.14 Precipitação do RNA
7.14.1 Materiais
7.14.2 Procedimento
Referências


Parte IV – Amplificação gênica

Capítulo 8 – Desenho de iniciadores
8.1 Regras básicas para desenhar os primers
8.1.1 Tamanho dos iniciadores
8.1.2 Temperatura de desnaturação do primer
8.1.2.1 Cálculo básico
8.1.2.2 Cálculo dependente de sal
8.1.2.3 Cálculo baseado em termodinâmica
8.1.3 Temperatura de anelamento do iniciador (Ta)
8.1.4 Conteúdo de G-C
8.1.4.1 Repetições e runs
8.1.5 Grampo de GC (clamp de GC)
8.1.6 Estruturas secundárias dos primers
8.1.6.1 Grampos (hairpins)
8.1.6.2 Dímero de primers senso (self dimer)
8.1.6.3 Dímero de primers antissenso (cross dimer)
8.1.6.4 Evite estruturas secundárias no molde (template do DNA)
8.1.6.5 Evite homologia cruzada
8.2 Iniciadores degenerados
8.2.1 Exemplo de primer degenerado e uso de inosina
8.3 Desenhando os iniciadores
8.3.1 Desenho de primers degenerados
8.3.1.1 Usando os programas
8.4 Testando os iniciadores
Referências


Capítulo 9 – Reação em cadeia da polimerase – PCR
9.1 Material necessário
9.2 Diluição dos iniciadores (primers)
9.3 Escolha da polimerase
9.4 Metodologia da PCR
9.4.1 Protocolo básico para o preparo da “mistura de PCR”
9.4.1.1 Reagentes
9.4.1.2 Procedimento
9.5 Contaminação
9.6 Aperfeiçoamento
9.6.1 Hot Start
9.6.2 PCR Booster
9.6.3 PCR Touchdown
9.7 Inibidores
9.8 Aditivos
9.9 PCR de colônia
9.9.1 Protocolo básico de PCR de colônia
9.9.1.1 Reagentes
9.9.1.2 Procedimento
Referências


Capítulo 10 – PCR em tempo real
10.1 Síntese de cDNA
10.1.1 Eliminação de DNA (protocolo promega)
10.1.2 Síntese de cDNA (protocolo promega)
10.1.2.1 Desnaturação do RNA
10.1.2.2 Mix para transcrição reversa
10.1.2.3 Programa de síntese de cDNA (um ciclo de cada passo)
10.2 PCR em tempo real: procedimento
10.3 Detecção não específica de corantes de ligação ao DNA
10.4 Preparação da amostra de cDNA
10.5 Sondas de detecção específicas e alvo-específicas
10.5.1 Sondas TaqMan (TaqMan® Probes)
10.5.1.1 Funcionamento da sonda TaqMan®
10.5.1.2 Parâmetros utilizados para desenhar um ensaio TaqMan®
10.6 PCR Multiplex
Referências


Capítulo 11 – Sequenciamento de DNA
11.1 Purificação do DNA para sequenciamento
11.2 Produto de PCR
11.3 Protocolo SAP-EXO
11.3.1 Material necessário
11.3.2 Procedimento:
11.4 Recuperando o DNA a partir dos kits de purificação de PCR
11.5 Vetores
11.6 Quantificação do DNA
11.6.1 Gel de eletroforese de agarose
11.6.2 Espectrofotometria
11.7 Sequenciamento pelo método do BigDye® Terminator v3.1 Cycle sequencing kit
11.7.1 Reagentes para volume final de 15 μL
11.7.2 Reagentes para volume final de 20 μL
11.7.3 Precipitação do produto amplificado a ser sequenciado
11.7.4 Injetando as amostras
Referências


Capítulo 12 – Mineração em bancos de dados biológicos
12.1 O receptor de quimiocina do tipo 5 (CCR5) e o vírus da imunodeficiência humana (HIV)
12.2 Entrez e PubMed
12.3 Explorando outros bancos
12.3.1 Protein: base de dados das sequências
12.3.2 Structure: estruturas tridimensionais macromoleculares
12.3.3 Nucleotide: subconjunto central de registros de sequência de nucleotídeos
12.3.4 GSS (genome survey sequence): sequência de análise do genoma
12.3.5 Gene: informação centrada em genes
12.3.6 BioSystems: rotas e sistemas de moléculas de interação
12.3.7 GEO Profiles: perfis de expressão e de abundância molecular
12.3.8 PubChem BioAssay: quadro de bioatividade de substâncias químicas
Referências


Parte V – Proteínas

Capítulo 13 – Análise e quantificação de proteínas
13.1 Quantificação de proteínas por espectrofotômetro
13.1.1 Método de Bradford
13.1.1.1 Reagentes
13.1.1.2 Preparo da curva padrão
13.1.1.3 Preparo da solução B
13.1.1.4 Procedimento:
13.1.2 Método de Lowry
13.1.2.1 Reagentes
13.1.2.2 Solução A
13.1.2.3 Solução B
13.1.2.4 Solução C
13.1.2.5 Solução
13.1.2.6 Solução E
13.1.2.7 Procedimento
13.1.3 Método de Lowry modificado
13.1.3.1 Reagentes
13.1.3.2 Procedimentos da solução CTC
13.1.3.3 Reagente de Lowry
13.1.3.4 Reagente de Folin 0,4N
13.1.3.5 Solução padrão de Albumina 1 mg/mL
13.1.3.6 Procedimento
13.2 Eletroforese unidimensional de proteínas em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE); gel desnaturante
13.2.1 Gel de concentração
13.2.1.1 Protocolo de gel a 4%
13.2.1.2 Protocolo de gel a 5%
13.2.2 Tampões de amostra
13.2.2.1 Reagentes
13.2.2.2 Procedimento
13.2.3 Eletroforese
13.2.3.1 Reagentes
13.2.3.2 Procedimento
13.3 Coloração de proteínas com Azul de Coomassie
13.3.1 Reagentes
13.3.1.1 Solução corante
13.3.1.2 Solução descolorante
13.3.2 Procedimento
13.4 Coloração de proteínas com prata I
13.4.1 Reagentes
13.4.1.1 Solução A
13.4.1.2 Solução B
13.4.1.3 Solução C
13.4.1.4 Solução reveladora
13.4.2 Procedimento
13.5 Coloração de proteínas com prata II
13.5.1 Reagentes
13.5.1.1 Solução de DTT
13.5.1.2 Solução de nitrato de prata
13.5.1.3 Solução reveladora
13.5.2 Procedimento
13.6 Coloração de proteínas com prata III
13.6.1 Reagentes
13.6.1.1 Solução fixadora
13.6.1.2 Solução de lavagem
13.6.1.3 Solução preparadora
13.6.1.4 Solução de coloração
13.6.1.5 Solução reveladora
13.6.1.6 Solução de parada
13.6.1.7 Solução de armazenamento
13.6.2 Procedimento
13.7 Descoloração de géis
13.7.1 Descoloração de géis corados com prata I
13.7.1.1 Reagentes
13.7.1.2 Solução descolorante
13.7.1.3 Procedimento
13.7.2 Descoloração de géis corados com prata II
13.7.2.1 Reagentes
13.7.2.2 Procedimento
Referências


Capítulo 14 – Expressão de genes e proteínas
14.1 Regiões controladoras
14.2 Marcadores, caudas e sítios de clivagem
14.3 Subclonagem
14.4 Seleção de um hospedeiro adequado
14.5 Células de mamíferos
14.5.1 Células de camundongos
14.5.2 Células de hamsters
14.5.3 Células de ratos
14.5.4 Células COS
14.5.5 Células embrionárias de rim humano
14.5.6 Outras células humanas
14.5.7 Células de drosófila
14.6 Leveduras
14.7 Expressão de proteínas em procariotos
14.8 Indução com IPTG
Referências


Capítulo 15 – Vetores
15.1 Seleção de um vetor de expressão
15.1.1 Regiões promotoras
15.1.2 Região de poliadenilação
15.1.3 Marcadores de seleção
15.1.4 Regulação da expressão
15.1.5 Sistemas de vetores simples e duplos
15.2 Vetores para clonagem de plantas
15.2.1 Vetores provenientes de Agrobacterium tumefaciens
15.2.2 Transferência direta de DNA
15.3 Vetores de clonagem em insetos
15.3.1 Elementos P de Drosophila melanogaster
15.3.2 Vetores de clonagem baseados em vírus de insetos
15.4 Vetores de clonagem em mamíferos
15.4.1 Simian virus 40 (SV40)
15.4.2 Adenovírus
15.4.3 Vírus associados ao adenovírus (AAV)
15.4.4 Papiloma vírus bovino
15.5 Vetores de leveduras
15.6 Vetores de bactérias
15.6.1 Bacteriófagos
15.6.2 Plasmídeos
15.6.3 Fagemídios
15.6.4 Cosmídeos
15.6.5 Outros tipos de vetores
15.6.5.1 Derivados do bacteriófago P1
15.6.5.2 PAC (cromossomo artificial P1)
15.6.5.3 BAC (cromossomo artificial bacteriano)
15.7 Lendo o mapa de um vetor
15.8 Isolamento e purificação de vetores
15.9 Isolamento e purificação de DNA plasmidial bacteriano por lise alcalina
15.9.1 Reagentes
15.9.1.1 Solução GETL
15.9.1.2 Acetato de potássio
15.9.2 Procedimento
15.10 Isolamento e purificação de DNA plasmidial bacteriano por ebulição: miniprep
15.10.1 Reagentes
15.10.2 Solução STET
15.10.2.1 Para 100 mL
15.10.3 Preparo de RNase
15.10.4 Procedimento
15.11 Isolamento e purificação de DNA plasmidial de levedura
15.11.1 Reagentes
15.11.1.1 Tampão de Lise
15.11.2 Procedimento
Referências


Capítulo 16 – Transformação
16.1 Preparação de bactérias competentes pelo método de cloreto de cálcio
16.1.1 Material necessário
16.1.2 Procedimento
16.2 Preparação de bactérias competentes pelo método de magnésio (ou sais)
16.2.1 Material necessário
16.2.1.1 Preparo do tampão de transformação
16.2.2 Procedimento
16.3 Preparo de células eletrocompetentes
16.3.1 Material necessário
16.3.2 Procedimento
16.4 Transformação de bactérias com plasmídeos pelo método de choque térmico
16.4.1 Material necessário
16.4.2 Procedimento
16.5 Transformação de células E. coli por eletroporação
16.5.1 Material necessário
16.5.2 Procedimento
16.6 Transformação de leveduras
16.6.1 Reagentes
16.6.2 Material necessário
16.6.3 Procedimento para obtenção de células competentes
16.7 Procedimento para transformação
16.7.1 Material necessário
16.7.2 Procedimento:
16.8 Transformação rápida e fácil de leveduras (método TRAFO)
16.8.1 Material necessário:
16.8.2 Procedimento:
16.9 Transformação de leveduras; método do acetato de lítio
16.9.1 Material necessário:
16.9.2 Procedimento:
Referências


Capítulo 17 – Visualização e manipulação in silico de proteínas tridimensionais
17.1 Swiss-PDBViewer
17.1.1 Obtenção e instalação
17.1.2 Utilização
17.1.3 Painel de controle (CP)
17.1.4 SPDBV-Color
17.2 Chimera
17.2.1 Abrindo uma molécula no Chimera (File)
17.2.2 Seleção & ação (Selection & Action)
17.2.3 Opções pré-definidas (Presets)
17.2.4 Ferramentas (Tools)
17.2.4.1 Controles gerais (General controls)
17.2.4.2 Controles de visualização (Viewing controls)
17.2.4.3 Análise estrutural (Structural analysis)
17.2.4.4 Comparação estrutural (Structure comparison)
17.3 Comentários adicionais
Referências


ANEXO I

ANEXO II

Sobre os autores